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首次利用激光捕获显微北京大学刘伟教授团队

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  球孢子菌病是由双相真菌Coccidioides immitis和Coccidioides posadasii菌引起的感染性疾病,通常流行于美国西南部、加利福尼亚和墨西哥,为北美地区非常重要的地方流行性真菌病,病死率高,严重危害民众健康。目前,随着国际交流和旅游的不断发展,在非流行地区报告的输入性病例逐渐增多。

  球孢子菌病在临床上表现非特异性,在非流行地区容易被误诊为肿瘤或其它感染性疾病,譬如结核病。激光切割机因而,其准确诊断对于精准治疗、提高患者治愈率具有重要意义。目前,球孢子菌病的诊断主要依据暴露史、临床表现和实验室检查。有呼吸系统临床表现的流行地区近期旅游史的患者应考虑球孢子菌病的可能性;实验室检查包括组织病理学检查、病原体的分离和培养、血清学检查及针对病原真菌的分子生物学检查和鉴定方法等。组织病理学检查是诊断的金标准;病原菌培养需要在3级生物安全实验室中进行,首次利用激光捕获显微从生物安全的角度对于实验室条件和资质的要求较高,而且还可能导致潜在的实验室传播。在非流行地区,血清抗体筛查通常无法常规进行,而且其诊断价值亦有限。如果临床标本无法进行培养以确定病原真菌菌种时,以先进的手段从石蜡包埋的组织中检测病原真菌并鉴定菌种,则是鉴定球孢子菌的可靠而且有助于精准诊断的方法。

  该研究报告了首次利用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)联合PCR扩增和Real-time PCR及新一代测序技术(New generation sequencing,NGS)对一例输入性肺球孢子菌病进行了准确分子诊断的病例。中国为球孢子菌病的非流行区,但近年来输入性病例在逐渐增多,容易误诊为肿瘤、结核病等;为了提高我国医务人员在临床上对该病的认识,课题组还将截至投稿前中国所有已报告的球孢子菌病共47例进行了回顾性分析和整理。结果显示,由于球孢子菌病在中国属于少见甚至罕见的严重真菌感染性疾病,诊断手段非常有限;已报告的47例球孢子菌病例中,在无法培养或培养阴性的临床标本中均未能检测出球孢子菌。而该课题组对于此次接诊的该患者,自组织病理学检查发现球孢子菌的特征性球体和内生孢子(如图1)等典型形态后,利用LCM技术从福尔马林固定和石蜡包埋(formalin fixed and paraffin-embedded,FFPE)的肺组织切片中获取线),提取真菌基因组DNA,通过PCR-Sanger测序、Real-time PCR(如图3)和NGS等方法检测到Coccidioidesspp.

  图1. 组织病理学检查。PAS染色(A)和GMS染色(B)显示肺结节内有多个厚壁球体和内生孢子(箭头)。

  图2. 利用LCM从FFPE组织切片中分离真菌成分。(A)LCM前可见散在分布于肺泡中的紫红色、圆形真菌孢子(箭头)。(B)在无菌环境中利用LCM对真菌孢子进行分离、切割。

  图3. 利用球孢子菌特异性TaqMan探针和从LCM分离的FFPE组织中提取的真菌DNA作为模板的Real-time PCR扩增曲线。

  本研究为无法培养、FFPE的组织中球孢子菌及其它真菌或病原的准确鉴定提供了新的思路,对感染性疾病分子病原学诊断提供了重要参考。

  北京大学医院刘伟教授为该论文的通讯作者,北京大学刘伟教授团队杨欣雨博士和宋营改助理研究员为该论文的共同作者。该研究得到了国家自然科学基金、“十三五”国家科技重大专项-艾滋病等传染病防治重大专项和国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目的支持。

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